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BioExplore-5

    大量经典RBP被发现定位在质膜上，并于糖基化RNA共同参与穿透肽跨膜运输

       长久以来，有报道称某些RBP缺乏经典跨膜结构域，如已发现的核仁蛋白NCL，以csNCL（cell surface NCL)形式存在于质膜上，对核糖体功能十分关键。

       穿透肽是一种可以穿透质膜的小分子，如HIV的一种转录因子因具有穿透肽TAT而可以跨膜。TAT带正电荷，过往一直认为其与质膜蛋白聚糖负电荷的吸附密切相关，因此作者设想带负电的RNA同样可以介导此过程。

       首先将膜蛋白数据库与RBP数据库交叉，选出其中高置信度的成员作为此次研究的数据库。

       使用高碘酸Periodate、NHS、Other三种方法鉴定数据库中的RBP，有19.6%在三种方法都被检出(csRBP)，有15%三种方法均未检出（never RBP)，两种方法检出的称（other RBP）。

       进一步分析三类RNP的结构，发现csRBP富含非典型RNA binding domain，never RBP则富含Zinc Finger。此种分类在四中细胞系中得到验证，尽管不同细胞系的三种RBP表达水平存在差异。

       由于periodate可以检出许多RBP，所以作者猜测许多RBP可能是glycoprotein（想想periodate-Schiff反应），所以作者在糖肽数据库中检索。果不其然，csRBP有75%存在于N-糖肽数据库。作者又用SNA凝集素和lectin IP来拉质膜糖蛋白，在神经氨酸酶Sialidase处理后，属RBP的DDX21条带消失，证明部分csRBP确实有糖基化。

       现在，我们拥有了膜RBP的基本分类，也对其化学本质有了初步认识，是时候确认其在整个细胞中的定位了。利用活细胞抗体染色，共聚焦观察。与质膜表面凝集素的共染色确定了csRBP存在于质膜，而被归为neverRBP的RIOK1则无法在活细胞上观察到，只有固定后才在核仁中出现信号。用质膜蛋白β2M共染色得到一样的结果。以上说明，csRBP局限于质膜。作者还构建了DDX21-HALO的Hela细胞系进一步确认。

       csRNP的表达是普遍的，但也是异质的，在四种细胞系的表达各有特点。csRBP的含量与经典膜蛋白相差不大。

       那么，csRBP是以什么样的方式在膜上组织的呢？共聚焦发现其在细胞表面聚集成簇，于是用SR单分子显微镜进一步分析。显然，与β2M的较均匀分布不同，几种csRBP的分布只限于特定区域。不同细胞系的大小存在差异，但簇间距大体相当。

       通过生物素-苯酚邻近标记，可见三种csRBP的共定位频度远高于csRBP与β2M的共定位频度，提示csRBP占据特殊的位置。配对共定位实验进一步验证了这种观点。

       同为RNA，csRBP是否会与糖基RNA结合呢？果不其然，两者荧光信号重叠，共定位分析与定量分析则更严谨地证明了这个观点。RNase的处理验证了荧光信号是来自质膜RNA，且处理后做个WB，检出的蛋白质都是csRBP，提示其通过RNA部分与质膜结合。

       将RNA抗体9D5-辣根过氧化物酶与cell孵育，再做个邻近标记，csRBP被生物素大量标记，验证其与质膜RNA互作的假说。

       最后，终于能回到穿透肽了。与TAT-WT-EGFP孵育，再与9D5共染色，观察到两者共定位，也即TAT穿透肽与糖RNA-csRBP极有可能互作。邻近标记验证了共定位。RNase处理后，结合力下降30%，内化率下降43%，提示glycoRNA-csRNA介导穿透肽的结合与内化。将穿透肽突变为TAT-R5K-EGFP后，结合率基本不变，内化率则降低39.2%，且胞质分布改变，可作为以后的研究方向。

       本文揭示了csRBP这一方向上的认识空白，糖蛋白的许多重要功能也许都依赖着RNA来实现。RNA处在稳定性与异质性的中间，非编码RNA往往展现她奥妙而神奇的功能，也许在不久的将来，csRBP会给人类带来一个全新的质膜模型。

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好复杂的文章，研究了一整天。。。

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